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1.1 定義: 分光光度法是利用物質所特有的吸收光譜來鑒別物質或測定其含量的分析檢測技術.
1.2 特點: 靈敏,精確,快速和簡便,在復雜組分系統(tǒng)中,不需要分離,即能檢測出其中所含的極少量物質.
1.3 應用: 生物<>化學研究中廣泛使用的方法之一,廣泛用于糖,蛋白質,核酸,酶等的快速定量檢測.
2. 分光光度計的基本結構和工作原理
2.1 分光光度計的分類
2.2 分光光度計工作原理
2.3 分光光度計的基本結構
2.4 分光光度法的測量誤差
2.5 顯色反應及其影響因素
2.1 分光光度計的分類
分光光度計的分類
紅外分光光度計: 測定波長范圍為大于760 nm的紅外光區(qū)
可見光分光光度計: 測定波長范圍為400~760 nm的可見光區(qū)
紫外分光光度計: 測定波長范圍為200～400 nm的紫外光區(qū)
2.2 分光光度計工作原理
人眼可見的光只占電磁波譜的很小—部分(400~760nm)
它是一種頻率較大的電磁波.電磁波按頻率大小,從頻率最小的無線電波到頻率最大的γ-射線排成一列,即組成電磁波的波譜,如下圖所示.
2.2.1 分光光度計的光譜范圍
包括波長范圍為400~760 nm的可見光區(qū)和波長范圍為200～400 nm的紫外光區(qū).不同的光源都有其特有的發(fā)射光譜,因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源.
鎢燈的發(fā)射光譜:鎢燈光源所發(fā)出的400～760nm波長的光譜,光通過三棱鏡折射后,可得到由紅,橙,黃,綠,藍,靛,紫組成的連續(xù)色譜;該色譜可作為可見光分光光度計的光源.
氫燈的發(fā)射光譜:氫燈能發(fā)出185～400 nm波長的光譜,可作為紫外光光度計的光源.
2.2.2 物質的吸收光譜(1)
如果在光源和棱鏡之間放上某種物質的溶液,此時在屏上所顯示的光譜已不再是光源的光譜,它出現了幾條暗線,即光源發(fā)射光譜中某些波長的光因溶液吸收而消失,這種被溶液吸收后的光譜稱為該溶液的吸收光譜.
不同物質的吸收光譜是不同的.因此根據吸收光譜,可以鑒別溶液中所含的物質.
2.2.2 物質的吸收光譜(2)
當光線通過某種物質的溶液時,透過的光的強度減弱.因為有一部分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被組成此溶液的物質所吸收,只有一部分光可透過溶液.
入射光 = 反射光 + 分散光 + 吸收光 + 透過光
如果我們用蒸餾水(或組成此溶液的溶劑)作為"空白"去校正反射,分散等因素造成的入射光的損失,則:
入射光 = 吸收光 十 透過光
2.2.3 物質吸光度(A)與透射比(T)的關系
設 I0 為經過空白校正后入射光的強度;I 為透過光的強度.
根據實驗得知 I = I0 ?10-εc l
式中,c 表示吸收物質的摩爾濃度;l 表示吸收物質的光徑,用cm表示;ε表示吸收物質的摩爾消光系數,它表示物質對光的吸收特性,不同物質的ε數值不同. 所以 I / I0 = 10-εc l
令 T(透射比) = I / I 0 T = 10-εcl
若以T對吸收物質的濃度作圖,則得圖1-5-2中的曲線.
由上式可得 1g(1 / T) = εc l
lg(l / T)為物質的吸光度(A) A = 1g(1 / T)
2.2.4 Lambert -Beer定律( E = εc l)
上式說明了物質的吸光度與吸收物質的濃度和液層的厚度成正比,這就是光吸收的基本定律--Lambert-Beer(朗伯-比耳)定律.
2.3 分光光度計的基本結構
無論哪一類分光光度計都包括 :光源,單色器,吸收池,檢測器和測量儀表.分光光度計各部件的次序如圖所示:
5個基本部件
分光光度計的基本部件(1):
光 源: 分光光度計上常用的光源有兩種:鎢絲燈或氫燈,在可見光區(qū),近紫外光區(qū)和近紅外光區(qū)常用鎢絲燈作為光源;在紫外光區(qū)多使用氫弧燈.
單色器:把混合光波分解為單—波長光的裝置.在分光光度計中多用 作為色散元件.
吸收池比色杯,比色皿,比色池)一般由玻璃,石英或熔凝石英制成,用來盛被測的溶液.在低于350 nm的紫外光區(qū)工作時,必須采用石英池或熔凝石英池.
分光光度計的基本部件(2):
吸收池(比色皿)必須與光束方向垂直.此外,每套比色皿的質料,厚度應完全相同,以免產生誤差.比色皿上的指紋,油污或壁上的沉積物都會顯著地影響其透光性,因此在使用前務必徹底清洗.
常用光電池,光電管和光電倍增管三種.
測量裝置 —般常用的紫外光和可見光分光光度計有3種測量裝置,即電流表,記錄器和數字示值讀數單元.現代的儀器常附有自動記錄器,可自動描出吸收曲線.
檢測器
棱鏡與光柵
棱 鏡: 光波通過棱鏡時,不同波長的光折射率不同;因而能將不同波長的光分開.玻璃對紫外線的吸收力強,故玻璃棱鏡多用于可見光分光光度計.石英棱鏡可在整個紫外光區(qū)傳播光,故在紫外光分光光度計中廣為應用.
衍射光柵: 在石英或玻璃表面上刻劃許多平行線(每英寸約刻15 000—30 000條).由于刻線處不透光,通過光的干涉和衍射使較長的光波偏折角度大,較短的光波偏折角度小,因而形成光譜.
棱鏡單色器裝置示意圖
光源照到棱鏡(或光柵)以前,先要經過一個入射狹縫,再通過平行光鏡使成為平行光束投到棱鏡上.透過棱鏡的光再經另一聚光鏡,在此聚光鏡的焦面內可得一清 楚的光譜圖.如在焦線處放—出射狹縫,轉動棱鏡使光譜移動,就可以從出射狹縫射出所需要的單色光.整個裝置稱為"單色器"
檢測器---光電池
光電池 裝在一個特制的匣子里面由3層物質組成的圓形或長方形薄片.第一層是一種導電性良好的金屬,這是光電池的負極.中間極薄的一層是半導體硒,第3層是鐵,這 是光電池的正極.當光電池受光照射以后,半導體硒的表面逸出電子,這些電子只向負極方向移動,而不向正極移動,因此在上下兩金屬片間產生一個電位差,線路 連通時即產生電流
檢測器---光電管
光電管 光電管是由封裝在真空透明封套里的一個半圓柱型陰極和一個絲陽極組成.陰極的凹畫上有一層光電發(fā)射材料,此種物質經光照射可發(fā)射電子.當在兩極間加有電位 時,發(fā)射出來的電子就流向絲陽極而產生光電流.對于相同的輻射強度,它所產生的電流約為光電池所產生電流的1/4.由于光電管具有很高的電阻,所以產生的 電流容易放大 .
檢測器---光電倍增管
光電倍增管 它比普通的光電管優(yōu)越,它可將第一次發(fā)射出的電子數目放大到數百萬倍 .當電子打在兼性陽極上時,能引起更多的電子自表面射出.這些射出的電子又被第二個兼性陽極所吸引,同樣再產生更多的電子.
此過程重復9次后,每個光子可形成106~107個電子.這些電子最后被收集在陽極上.所得到的倍增電流可進一步加以放大和測量.
2.4 分光光度法的測量誤差
分光光度法的測量誤差
選擇適宜波長的入射光
控制吸光度A的遍數范圍
選擇適當的參比溶液
儀器測
量誤差
測量條
件選擇
2.4.1 儀器測量誤差
由朗伯-比爾定律可知,只有在一定的濃度范圍內,即一定的吸光度范圍同內,由分光光度計測量所引起的測定結果的相對誤差才是較小的;當透光率接近0或 1.0時,其相對誤差趨于無限大;一般在百分透光率在10~80%的范圍內(即吸光度在1~0.1),濃度測量相對誤差較小;對于精密度高的儀器.當吸度 A=0.7-0.2時(百分透光率約為20-60%,測量誤差約為1%.
2.4.2 測量條件選擇
(1)選擇適宜波長的入射光:由于有色物質對光有選擇性吸收,為了使測定結果有較高的靈敏度,必須選擇溶液最大吸收波長的入射光.
(2)控制吸光度A的準確的讀數范圍:由朗伯-比耳定律可知,吸光度只有控制在0.2~0.7讀數范圍內時,測量的準確度較高.
(3)選擇參比溶液:參比溶液是用來調節(jié)儀器工作零點的.若樣品溶液,試劑,顯色劑無無色可用蒸餾水作參比溶液;反之應采用不加顯色劑的樣品液作參比溶液.
2.5 顯色反應及其影響因素
顯色反應及其影響因素
顯色反應
一般要求
影響顯色
反應因素
選擇性好
靈敏度高
生成的有色化合物性質穩(wěn)定
顯色劑與有色物顏色反差大
顯色反應要易于控制
顯色劑用量
反應液的酸堿度(pH)
反應溫度
顯色反應時間
干擾離子的影響
2.5.1 顯色反應一般要求
(1)選擇性好:顯色劑最好只與一種被測組分起顯色反應;
(2)靈敏度高:靈敏度高有笪微量組分的測定;
(3)有色化合物性質穩(wěn)定:確保前后測定準確.
(4)顯色劑與有色物顏色反差大:兩者最大吸收波長之差應大于60nm;
(5)顯色反應要易于控制:結果的確保實驗再現性.
2.5.2 影響顯色反應的主要因素
(1)顯色劑用量:通過實驗來確定最適用量;
(2)反應液的酸堿度(pH)溶液酸堿度直接影響金屬離子與顯色劑存在形式以及有色化合物組成的穩(wěn)定性.
(3)反應溫度:不同的顯色反應需要不同的反應溫度,一般顯色反應可在室溫下完成.
(4)顯色反應時間:顯色反應的速度有快有慢.
(5)干擾離子的影響:應采用適當方法消除其影響.
