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pcr儀簡介
[ 2013/8/28 18:16:17 ] [轉載請注明來源:就是要儀器網(wǎng)]

根據(jù)DNA擴增的目的和檢測的標準,可以將PCR儀分為普通PCR儀,梯度PCR儀,原位PCR儀,實時熒光定量PCR儀四類。

PCR的要素

基本的PCR須具備

1.要被復制的DNA模板 Template.界定復制范圍兩端的引物Primers.

3.DNA聚合酶Taq. Polymearse

4.合成的原料(四種脫氧核苷酸)及水。

PCR儀工作原理

利用升溫使DNA變性,用限制性內(nèi)切酶使DNA雙鏈解鏈,在聚合酶的作用下使單鏈復制成雙鏈,進而達到基因復制的目的[1]

PCR的反應包括三個主要步驟

分別是1. Denaturation 2. Annealing of primers,3. Extension of primers。 所謂 Denaturing乃是將DNA加熱(至90~95)變性, 將雙股的DNA加熱后轉為單股DNA以做為復制的模板Annealing 則是令 Primers于一定的溫度下(冷卻至55~60)附著于模板DNA兩端。 最后在DNA聚合酶e.g. Taq-polymerase 的作用下(加熱至70~75)進行引物的延長 Extension of primers及另一股的合成。

PCR的最早設想核酸研究已有100多年的歷史,本世紀60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術,Korana1971年最早提出核酸體外擴增的設想:經(jīng)過DNA變性,與合適的引物雜交,用DNA聚合酶延伸引物,并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因

PCR的實現(xiàn)

1985美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似于DNA的體內(nèi)復制。 

PCR儀的分類

普通的PCR

把一次PCR擴增只能運行一個特定退火溫度的PCR,叫傳統(tǒng)的PCR儀,也叫普通PCR儀。如果要做不同的退火溫度需要多次運行。主要是做簡單的,對目的基因退火溫度的擴增。該儀器主要應用于科研研究,教學,醫(yī)學臨床,檢驗檢疫等機構。

梯度PCR

把一次性PCR擴增可以設置一系列不同的退火溫度條件(溫度梯度),通常有12種溫度梯度,這樣的儀器就叫梯度PCR。因為被擴增的不同DNA片段,其最適退火溫度事不同,通過設置一系列的梯度退火溫度進行擴增,從而一次性PCR擴增,就可以篩選出表達量高的最適退火溫度,進行有效的擴增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴增,這樣節(jié)約成本的同時也節(jié)約了時間。主要用于科研,教學機構。梯度PCR儀,在不設置梯度的情況下也可以做普通PCR擴增。[2]

原位PCR

用于從細胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細胞內(nèi)基因擴增儀,如病源基因在細胞的位置或目的基因在細胞內(nèi)的作用位置等。是保持細胞或組織的完整性,使PCR反應體系滲透到組織和細胞中,在細胞的靶DNA所在的位置上進行基因擴增,不但可以檢測到靶DNA,又能標出靶序列在細胞內(nèi)的位置,于分子和細胞水平上研究疾病的發(fā)病機理和臨床過程及病理的轉變有重大的實用價值。

實時熒光定量PCR

在普通PCR儀的基礎上增加一個熒光信號采集系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng),就成了熒光定量PCR儀。其PCR擴增原理和普通PCR儀擴增原理相同,只是PCR擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進行標記,使用引物和熒光探針同時與模板特異性結合擴增。擴增的結果通過熒光信號采集系統(tǒng)實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統(tǒng)得出量化的實時結果輸出。把這PCR儀叫做實時熒光定量PCR(qPCR)。熒光定量PCR儀有單通道,雙通道,和多通道。當只用一種熒光探針標記的時候,選用單通道,有多熒光標記的時候用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標記的目的基因表達產(chǎn)物,因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量,需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量。該儀器主要用于醫(yī)學臨床檢測,生物醫(yī)藥研發(fā),食品行業(yè),科研院校等機構。[2]

 

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