一、適用范圍

　　本操作方法適用配合飼料、濃縮飼料和單一飼料。

　　二、方法概述及原理

　　飼料中粗蛋白質包括真蛋白質和非蛋白質兩部分含氮物質，后者主要包括游離氨基酸、硝酸鹽、銨鹽等，不能或不易被動物吸收，故不能反映出飼料蛋白質對動物的真正營養(yǎng)價值。本方法是在凱氏定氮方法的基礎上進行相應的前處理從而達到測定真蛋白的目的。

　　蛋白質經(jīng)沸水提取并在一定堿性條件下，能與硫酸銅發(fā)生鹽析作用而析出沉淀，此沉淀物不溶于熱水，而非蛋白氮則易溶于水，用熱水洗沉淀，將水溶性含氮物洗去，剩下的沉淀物再用凱氏定氮法測定，得出真蛋白質的含量。

　　三、儀器與試劑

　　粉碎機、40目分樣篩、分析天平(感量0.1mg)、燒杯250ml、玻璃棒、漏斗(直徑10cm)、

　　定性濾紙(中速，12.5cm，15cm)、可控溫干燥箱、Hanon K1100F全自動凱氏定氮儀、

　　Hanon SH420石墨消解爐、可控溫電爐

　　濃硫酸(98%)、硫酸銅(分析純)、硫酸銅溶液(10%)、硫酸鉀、氫氧化鈉溶液(40%)、

　　氫氧化鈉溶液(2.5%)、硼酸(20g/L，按混合指示劑：硼酸=1:100加入指示劑)、

　　甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑(1:5)、硫酸標準溶液(C(1/2H2SO4)=0.1mol/L)、

　　氯化鋇溶液(5%)

　　四、實驗步驟

　　1. 前處理

　　將風干飼料樣品用飼料樣品粉碎機粉碎，通過40目(孔徑0.45 mm)篩，制得分析飼料樣本，備用。

　　準確稱取約0.5g試樣(精確至0.000 1 g)置于250 mL燒杯中，加75mL蒸餾水，加熱至沸，煮沸30min(保持75mL水)，加入2.5 %氫氧化鈉溶液20 mL，10 %硫酸銅溶液20 mL，用玻璃棒充分攪拌均勻，微沸一段時間，冷卻放置超過2 h。用定性濾紙過濾，然后用70~80 ℃熱水沖洗沉淀5次以上，用 5%氯化鋇溶液5滴和數(shù)滴鹽酸檢查濾液，直至不生成白色硫酸鋇沉淀。將沉淀和濾紙放在65 ℃烘箱烘干。

　　將干燥后的沉淀連同濾紙一起放入消化管中，加入15mL濃硫酸，3g硫酸鉀，0.2g硫酸銅，放在石墨消解爐上設置溫度梯度升溫消化(同時做空白試驗)。

　　2.真蛋白的測定

　　將冷卻后的消化管置于K1100F全自動凱氏定氮儀上，設置參數(shù)：硼酸20mL，堿 60mL，稀釋水10mL，蒸餾5min。測得蛋白質含量即為真蛋白含量。

　　五、注意事項

　　1.洗滌時要用60-80℃左右的熱水，可以減少洗滌次數(shù)。

　　2.必須要洗滌到氯化鋇不再產(chǎn)生白色沉淀為止，以確定非蛋白氮成分洗滌干凈。

　　3.沉淀要盡量烘干。